紫外可見(jiàn)吸收光譜主要產(chǎn)生于分子價(jià)電子在能級(jí)間的躍遷。利用一定頻率的紫外--可見(jiàn)光照射被分析的物質(zhì)，引起分子中價(jià)電子的躍遷，它將有選擇地被吸收。吸收光譜可以反映出物質(zhì)的特征。它對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析、定量分析及結(jié)構(gòu)分析, 所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中特定波長(zhǎng)的光而產(chǎn)生的吸收光譜。

按所吸收光的波長(zhǎng)區(qū)域不同，分為紫外分光光度法和可見(jiàn)分光光度法，合稱為紫外-可見(jiàn)分光光度法。

溶液對(duì)光的作用示意圖：

溶液對(duì)光吸收示意圖：

光吸收遵循朗伯-比爾定律：

I0--入射光輻射強(qiáng)度、I-- 透射光輻射強(qiáng)度、T --透射比、a--吸光系數(shù)、ε--摩爾吸光系數(shù)。

組成：光源、單色器，狹縫、樣品池、檢測(cè)器

1．光源：

　　①能提供連續(xù)的輻射；②光強(qiáng)度足夠大；③在整個(gè)光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長(zhǎng)有明顯變化；④光譜范圍寬；⑤使用壽命長(zhǎng)，價(jià)格低。 鎢燈——可見(jiàn)光區(qū) 320～2500nm

      氫燈或氘燈——紫外光區(qū) 195－375nm

2．單色器：包括狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件

　　單色器是分光光度計(jì)的心臟部分，它的作用是把來(lái)自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長(zhǎng)。它的主要組成部件和作用是：

    ①入射狹縫——限制雜散光進(jìn)入。

    ②色散元件——即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為單色光。 ③準(zhǔn)直鏡——把來(lái)自入射狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平等光，并把來(lái)自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。 

    ④出射狹縫——只讓特定波長(zhǎng)的光射出單色器。

3. 吸收池

     玻璃—由于吸收紫外UV光，僅適用于可見(jiàn)光區(qū)；石英—適用于紫外和可見(jiàn)光區(qū)。

4    檢測(cè)器

        檢測(cè)器的作用是檢測(cè)光信號(hào)，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)?，F(xiàn)今使用的分光光度計(jì)大多采用光電管或光電倍增管作為檢測(cè)器。

5．記錄裝置：常用的信號(hào)顯示裝置有直讀檢流計(jì)，電位調(diào)節(jié)指零裝置，以及自動(dòng)記錄和數(shù)字顯示裝置等。

按其光學(xué)系統(tǒng)可分為單波長(zhǎng)分光光度計(jì)和雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)。

單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)：

特點(diǎn)：使用時(shí)來(lái)回拉動(dòng)吸收池、對(duì)光源要求高、比色池配對(duì)

單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)：

特點(diǎn)：不用拉動(dòng)吸收池、可以減小移動(dòng)誤差、對(duì)光源要求不高、

可以自動(dòng)掃描吸收光譜。

雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)：

特點(diǎn)：

利用吸光度差值定量、消除干擾和吸收池不匹配引起的誤差。

一、 儀器測(cè)量條件的選擇

 1.適宜的吸光度范圍

由朗伯-比爾定律可知：

                               A=lg1/T=εcl  

微分后得：

                     dlgT=0.4343dT/T= -εldc

                    或    0.4343ΔT/T= -εlΔc

代入朗伯-比爾定律有：

                Δc/c=0.4343ΔT/TlgT

要使測(cè)定的相對(duì)誤差Δc/c最小，求導(dǎo)取極小得出：

                       lgT=-0.4343=A

即當(dāng)A=0.4343時(shí)，吸光度測(cè)量誤差最小。 

最適宜的測(cè)量范圍為0.2~0.8之間。

二、入射光波長(zhǎng)的選擇

 通常是根據(jù)被測(cè)組分的吸收光譜，選擇最強(qiáng)吸收帶的最大吸收波長(zhǎng)為入射波長(zhǎng)。當(dāng)最強(qiáng)吸收峰的峰形比較尖銳時(shí)，往往選用吸收稍低，峰形稍平坦的次強(qiáng)峰或肩峰進(jìn)行測(cè)定。 

三、狹縫寬度的選擇

為了選擇合適的狹縫寬度，應(yīng)以減少狹縫寬度時(shí)試樣的吸光度不再增加為準(zhǔn)。一般來(lái)說(shuō)，狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的十分之一。

四、顯色反應(yīng)條件的選擇

對(duì)多種物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，常利用顯色反應(yīng)將被測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢úㄩL(zhǎng)范圍有吸收的物質(zhì)。常見(jiàn)的顯色反應(yīng)有配位反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等。這些顯色反應(yīng)，必須滿足以下條件：

1．反應(yīng)的生成物必須在紫外-可見(jiàn)光區(qū)有較強(qiáng)的吸光能力，即摩爾吸光系數(shù)較大；

2．反應(yīng)有較高的選擇性，即被測(cè)組分生成的化合物吸收曲線應(yīng)與共存物質(zhì)的吸收光譜有明顯的差別；

3.  反應(yīng)生成的產(chǎn)物有足夠的穩(wěn)定性，以保證測(cè)量過(guò)程中溶液的吸光度不變；

4.反應(yīng)生成物的組成恒定。

五、參比溶液的選擇

測(cè)定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調(diào)節(jié)透光度（吸光度為0）為100%，以消除其它成分及吸光池和溶劑等對(duì)光的反射和吸收帶來(lái)的測(cè)定誤差。參比溶液的選擇視分析體系而定，具體有：

1．溶劑參比：試樣簡(jiǎn)單、共存其它成分對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)吸收弱，只考慮消除溶劑與吸收池等因素

2．試樣參比：如果試樣基體溶液在測(cè)定波長(zhǎng)有吸收，而顯色劑不與試樣基體顯色時(shí)，可按與顯色反應(yīng)相同的條件處理試樣，只是不加入顯色劑。

3．試劑參比：如果顯色劑或其它試劑在測(cè)定波長(zhǎng)有吸收，按顯色反應(yīng)相同的條件，不加入試樣，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。

4.  平行操作參比：用不含被測(cè)組分的試樣，在相同的條件下與被測(cè)試樣同時(shí)進(jìn)行處理，由此得到平行操作參比溶液。